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研究简讯家蚕抗菌肽，4组分杀菌机理的激光共聚焦显微镜观察徐进署张双全〃南京师范大学生命科学学院，南京21用抗菌肽处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，与对照组相比，它们的01值随时间明显下降，平板培养克隆数减少。以荧光素乃10标记抗菌肽作用于大肠杆菌金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌等细菌，用激光共聚焦扫描显微镜观察，发现抗菌肽迅速包围菌体，密集于细胞膜，损伤膜的完整性，出现大小不等的孔洞，菌体断裂，*后死。说明细菌膜结构是抗菌肽，攻击的首要靶位点。抗菌肽是昆虫先天免疫系统的重要成分。昆虫在受到刺激或非刺激状态下能迅速产生系列抗菌物质参与机体的免疫应答反应，其中*重要的是抗菌肽抗菌肽是类分子量小具广谱抗菌活性的蛋白质，来源非常广泛，昆虫两栖类哺乳类及植物体内都有分布，可在细菌导的抗菌肽23，对许多革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有杀灭作用。
黄自然等通过诱导免疫柞蚕分离纯化出柞蚕抗菌肽，对3种细菌有杀灭作用。家蚕抗菌肽结构与天蚕素06003相似，具有两亲性的螺旋结构，对多种细菌有杀伤作用。张双全等5报道家蚕抗菌肽，驯能破坏癌细胞，使癌细胞的微绒毛减少，造成癌细胞出现大量孔洞，*终成为碎片。
实验已经证明抗菌肽对威胁着人体健康的金黄色葡萄球菌绿脓杆菌等致病细菌有抑制杀伤作用。我们借助激光共聚焦扫描显微镜观察了家蚕抗菌肽对上述致病细菌的作用过程。
以期探讨抗菌肽的杀菌作用机理。
1材料与方法1.1塘种大肠杆菌，2031由瑞典斯德哥尔摩大学81教授赠送，南京师范大学国家自然科学基金资助项目批准号3977017联系人生命科学学院生物化学与分子生物学实验室保存金黄色葡萄球菌处知，仙和绿胺杆菌朽6，0010，0，0均由南京师范大学生命科学学院微生物研究室保存。
1.2家蚕抗菌肽0的分离纯化荧光标记大肠杆菌对家蚕蛹的诱导及免疫血淋巴的收集按照文献6的方法进行。抗菌肽0队组分的分离纯化及活性鉴定按文献7的方法进行。抗菌肽，峰的荧光标记采用只等8的方法。
1.3孔穴法检测抗菌肽抑菌活性融化10，固体培养基，冷却至45左右，按1001的比例加人对数生长期的绿脓杆菌，混匀，倒入直径9的平中，迅速铺平，待凝固后，于超净台内用灭过菌的不锈钢打孔器直径3打孔。孔内加满抗菌肽溶液，置36尤下培养，第2天观察结果。
1.4激光共聚焦显微镜观察大肠杆菌绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌于培养中涂布培养过夜，挑取细菌克隆于2！
18液中，振荡培养，分别收集对数期的上述3种细菌培养液，亍8000，28尤，离心4.去掉上清，用0.01几，837.4，含150呢，1如0洗2次。重悬浮于相同的磷酸缓冲液中，菌液浓度约为0131.取少许菌液涂于用多聚赖氨酸处理的载玻片上，加适量几标记的抗菌肽后，用8，1024激光共聚焦扫描显微镜观察抗菌肽与细胞的结合分布及杀伤细胞的过程。该显微镜由南京师范大学生命超滤水设备科学学院实验中心提供，其反6激光发生器的激光波长为488观察其495，发射光，像经1打43软件处理。
1.5抗菌肽对细菌生长的影响抗菌肽对细菌作用后00值的变化。接种的大肠杆菌于37丈下，振荡培养至对数期，加人抗菌肽，使其终浓度为0.55，8必，对照组加等量的无菌水。每隔20，1测其00值。
金黄色葡萄球菌也作同样处理。
抗菌肽对细菌作用的克隆数。大肠杆菌培养至对数期，用，18817.4洗涤，保持菌液浓度为07个1取菌液150儿与抗菌肽混合培养，抗菌肽终浓度为2不同时期取其稀释1000倍，涂布固体平板培养，37尤下培养过夜后计算菌落数。金黄色葡萄球菌亦作同样处理。
2.1孔穴法检测抗菌肽0对绿脓杆菌的抑制作用抗菌肽0能抑制病原菌绿脓杆菌的生长繁殖，由于抗菌肽在培养基中的渗透，导致平板上出现抑菌圈；随着抗菌肽量的增加，抑菌圈不断扩大，*后连成斤，呈明亮的空白斑状。结果明了抗菌肽，具有抗绿脓杆菌的活性。
2.2激光共聚焦显微镜观察为了检验抗菌肽与大肠杆菌绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌作用的靶位点，用，荧光标记物偶联2结果和讨论色炎光。标记的荧光素染料1冗对抗菌肽有抗菌活性。我们发现，Fc标记的抗菌肽能迅速包围菌体，聚集在细胞质膜面。
对大肠杆菌来说，观察明，标记抗菌肽首先大量地聚集于细胞膜上，使整个细菌呈个明亮的短杆。抗菌肽结合的密度并不是均，的，杆状的细菌两端结合的抗菌肽分子要多些。随着作用时间的延长，结合Fc抗菌肽的膜碎片脱落，菌体亮度逐渐减弱。细菌面出现了破损凹陷，菌体内容物外流，散布在周，细菌中间出现断痕，膜结构被破坏，*后细菌崩解，形成堆支离破碎菌，绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌膜与抗菌肽，凡的结合能力有所降低。在其细胞膜明显可以看出深浅不同的亮度区。抗菌肽分子聚集在金黄色葡萄球菌膜上，造成膜大面积的破损，*后形成了无细胞形态的碎片2，2了抗菌肽对绿脓杆菌的作用。可以看出，抗菌肽把长长的绿脓杆菌截断，促使残裂的菌体慢慢瓦解。时这些结果明抗菌肤首先作用丁细菌的膜。3，抗菌肽对大扬杆菌的作用过程，3菌体被抗菌肽包可，中国家蚕抗菌肽杀菌的方式也和060类似，抗菌肽首攻的耙位点是细胞膜，通过形成孔洞或渗透膜通透件来杀死细围幻抗菌肽密集细胞膜，始破裂到出现孔洞，60膜开始松散，中间出现断痕，4内荇物泄露，胞膜塌陷零散的膜碎片。，为金黄色葡萄球菌在抗菌肽作用下逐步破坏的过程。10被抗，肽破坏后的绿脓杆菌。但激光共聚焦断层扫描显小，抗菌耽菌包栝广各种状态菌体，抗菌肽刚结合菌体，形吣分子也能穿过膜与细胞内部的结构偶态完，体断裂正在崩解为碎片合，形成了2的细胞内腔的光亮区域2，1.推测细胞内部也有抗菌肽，吣挥，引起物质和能量代谢紊乱，细胞衰。在抗菌肽与绿脓杆菌作用的过程中，往往可以发现杆菌从头断裂成两截。显然由于抗菌肽分子的作用，细菌很难保持其完整性。从另方面看，抗菌肽分子是以聚集体的形式发挥功能的，当抗菌肽集合体结合于细菌膜上时，导致其他分子迅速集结环绕菌体切断胞膜，使其断成两节。
2.3抗菌肽对细茴生长的影响抗菌肽对细菌的抑制和杀灭作用可用菌液光密度值的变化来检测。当细菌悬液加人抗菌肽后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬液在63，1的光密度值始终比对照组低3，4.两者对照，抗阐肽时间min这些结果明抗菌肽，吣对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有杀伤作用。但在现方总是落后于对照组，这是它们的共同之处。它们的不同在于加人抗菌肽后，大肠反渗透水处理系统杆菌的，值先是下降，然后稍有回升；抗菌肽处理金黄色葡萄球菌的值尽管也落后于对照组，但没有下降的趋势，总体上仍然上升。这些现象说明，抗菌肽对金黄色葡萄球菌的杀伤活性可能与它金黄色葡萄球菌的成活菌落数目相差1大，在前30内抗菌肽对细菌的破坏性达到相当近似的水平。因此，可以认为抗菌肽CM4抗金黄色葡萄球菌不完全是通过溶解细胞这途径，可能还存在其他的杀菌方式。
大多数研究明，昆虫抗菌肽能杀死许多有害细菌真菌原虫及病毒等91.抗菌肽种类菌的，值随时间而下降，之后，略有回升，但还是与对照组相差颇大。这些结果明抗菌肽，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有杀伤作用，但两者对抗菌肽的敏感性存在差异，大肠杆菌对抗菌肽，的敏感性较高。
对细菌的杀伤作用迅速现出来。约20如右对照组的克降数骤然上升，加人抗菌肽后细菌的克隆数越来越少。
繁多，不可能用统的模式来解释它们的杀菌机制，不同的分子结构有不同的作用方式。家蚕抗菌肽属于带两亲性螺旋结构类别，这类家族还有。6，010，3等。它们都现为末端亲水末端疏水的高级结构。近来对这家族的几种抗菌肽组分的研究显，抗菌肽可以通过形成孔洞和增加膜的渗透性亦或破坏膜结构的方式杀死细菌。我们研究发现，抗菌肽可以进入细胞，与其内部结构结合。激光共聚焦断层扫描显，抗菌肽跨膜进人细胞内部，导致细胞内抗菌肽大量分布。从抗菌肽对细菌的，值及菌落生长的影响来分析，认为中国家蚕抗菌肽杀灭金黄色葡萄球菌时，可能是通过进人细胞内部干扰阻止了正常的细胞代谢从而导致细胞死。这问还在进步研究中。
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